Вход на сайт

Подготовительный этап глубокого обратимого охлаждения органов и целых животных (в процессе публикации...)

ПОДГОТОВИТЕЛЬНЫЙ ЭТАП ГЛУБОКОГО ОБРАТИМОГО ОХЛАЖДЕНИЯ ОРГАНОВ И ЦЕЛЫХ ЖИВОТНЫХ

Пульвер А. Ю., Рылькова Л. Н., Пульвер Н. А., Артюхов И. В., Перегудов А. Г.

Институт Биологии Старерия, Россия
pulver@bioaging.ru

Вступление

Охлаждению биологического объекта до криогенных температур предшествует стадия его охлаждения до 4-0°С при обязательном отсутствии дополнительных повреждений. Этот этап имеет важность не меньшую, чем собственно замораживание/витрификация, и последующее согревание.

Нам представляется, что проводить начальный этап подготовки органов к последующей криоконсервации удобнее всего прямо в организме донора. Подобная методика подготовки (в силу дефицита донорских органов при гигантском на них спросе) должна позволять произво- дить мультиорганный забор, как это более 20 лет и происходит в клинической транспланто- логии [Belzer & Southard 1988; Baumgartner, Williams et al. 1989; Bachet, Guilmet et al. 1991; Taylor, Rhee et al. 2005], когда “подготавливается” сразу весь организм.

Данная методика очень похожа на использование искусственного кровообращения на фоне гипотермии [Baumgartner, Silverberget al. 1983] или глубокой гипотермии [Connolly, Roy et al. 1965; Barratt-Boyes, Neutze et al. 1976; Southwick & Dalglish 1980; Ergin, O'Connor et al. 1982; Bachet, Guilmet et al. 1991] в кардиохирургии. Еще большая схожесть отмечается с методом ис- пользования гипотермии в сочетании с искусственным кровообращением при временной за- мене крови на искусственный перфузат. Это применялось в последней четверти XX века – например, при лечении сепсиса [Klebanoff 1972], или отравления угарным газом [Agostini, Ramirez et al. 1974] – в связи с недостаточным на тот момент развитием иных детоксикацион- ных методик.

Существующие на сегодняшний день методы подготовки к мультиорганному забору органов [Taylor, Rhee et al. 2005, Ramsay 2013] построены на тех же принципах, но с использованием бо- лее низкой температуры (10-15°C)[Baumgartner, Williams et al. 1989].

История вопроса

Клиническое применение гипотермии стало возможно благодаря возросшему во второй поло- вине XX века интересу к гибернации млекопитающих.

Первые же опыты показали возможность обратимой холодовой ишемии до околонулевых температур негибернирующих млекопитающих – крыс [Smith 1959; Andrews 2007] и даже со- бак [Gollan, Tysinger et al. 1955] (хотя последнее, на наш взгляд, сомнительно). И гибернирую- щих (хомяков), плоть до отрицательных температур (-6°С) [Andjus 1955; Smith 1956, 1959]. Животных охлаждали путем погружения в ледяную баню, сопровождая это легочной вентиля- цией. Выживаемость достигалась в тех случаях, когда согревание начинали локально с области проекции сердца на грудную клетку – разогретыми шпателями, струей жидкости или даже микроволновым излучением. Общее время клинической смерти достигало от 30 минут до по- лутора часов.

Существенно улучшить результаты (увеличить время клинической смерти от 1 до 5-6 часов в некоторых случаях) удалось, начиная с 60-х годов XX века, при помощи экстракорпорального кровообращения, которое позволяло как варьировать скорость охлаждения и согревания, так и заменять после достижения околонулевых температур кровь на перфузат, близкий по соста- ву к внутриклеточному. Подобные составы используются в настоящее время для бесперфузи- онного сохранения трансплантов.

Самыми популярными экспериментальными моделями являлись крысы [Alexander & Al Ani 1983; Sasaki, Takigami 1996; Fabre, Zegdi et al. 2001; Ma, Yang et al. 2003; Moehrlen, Stammberger et al 2003; Jungwirth, Mackensen et al. 2006; Gunzinger, Wildhirt et al. 2007; de Lange, Yoshitani et al. 2008] и собаки [Jesch, Sunder-Plassmann 1975; Haneda, Thomas et al. 1986; Kiyoshi, Thomas et al. 1986; Bailes, Leavitt et al. 1991; Neely & Haining 1994; Nozari, Safar et al. 2004]. Реже использова- лись свиньи [Neely, Haining et al. 1968; Klebanoff & Phillips 1969; Haff, Klebanoff et al 1975; Casas, Alam et al. 2007].

Такого рода исследования и позволили совершить переворот как в кардиохирургии, так отча- сти и в трансплантологии [Belzer & Southard 1988; Ramsay 2013].

Направление наших исследований

Для подготовки донорских органов к забору и их дальнейшей криоконсервации наиболее удобным нам представляется разработка своего варианта методики обратимой холодовой ишемии при 2°C – -7°С с заменой крови на перфузат, близкий по составу к растворам для холо- довой бесперфузионной консервации органов.

Разработка метода планируется на крысах. Впоследствии, с минимальными модификациями он будет адаптирована к применению на свиньях и впоследствии на человеческих кадаврах (трупах-донорах), что позволит улучшить качество получаемых трансплантов, а заодно и ча- стично подготовить их к криоконсервации.

В этих рамках нами уже освоен подготовительный этап: обратимая холодовая ишемия крыс при минимальной температуре 2-30С (рис. 1) с длительностью клинической смерти до 2 часов (рис. 3) и согревания грудной клетки струёй жидкости (рис. 2) с последующей реанимацией (рис. 4).

В 20-30 % случаев после оживления имело место "обморожение" передних, и изредка задних лап. Большой возраст и любые легочные заболевания, крайне негативно сказываются на вы- живаемости. Чтобы пережить вышеописанную процедуру крыса должна быть молодой и здо- ровой.

2018-07-19_01-18-57

2018-07-19_01-19-04

В состав разрабатываемой нами системы системы будет входить полноценный миниатюрный АИК (аппарат искусственого кровообращения) со скоростью перфузии 1-50 мл/мин, включа- ющий в себя роликовые насосы, модуль газообмена (оксигенатор), теплообменник, модуль контроля скорости тока жидкости, перфузионого давления и детекции микропузырьков. А также отдельный ионообменный блок с возможностью диализа и ультрафильтрации, с допол- нительным модулем контроля газов и электролитов перфузата (как минимум - pH, pO2, pCO2, pK+, pNa+, pCa2+).

Эта система будет использована для разработки модификаций состава перфузата, способству- ющих улучшению выживаемости после криоконсервации. Помимо улучшения ионного соста- ва, необходимо предусмотреть меры, направленные на нейтрализацию активных форм кисло- рода, активацию каскадов апоптоза и развития реперфузионного синдрома после заморажи- вания за счет использования:

•различных типов антиоксидантов, в ом числе комплексообразователей (антагонистов железа);
• ингибиторов каспаз, сериновых протеаз, матриксных металлопротеиназ, липоксигеназ и т. д.
• блокаторов различных ионных каналов;
• антагонистов кальция и NMDA-рецепторов;
• особое внимание будет уделено применению газообразных органопротекторов – ксено- на [Ma, Yang et al. 2003; Артюхов, Пульвер et al. 2014], H2S [Blackstone, Morrison et al. 2005; Baumgart, Georgieff et al. 2008] и др.

В конечном счете это должно позволить как увеличить длительность обратимой холодовой ишемии опытных организмов, так и улучшить качество криоконсервации органов.

Литература
1. Agostini JC, Ramirez RG, Albert SN, Goldbaum LR, Absolon KB. Successful reversal of lethal carbon monoxide intoxication by total body asanguineous hypothermic perfusion. Surgery 1974;75:213-9.
2. Alexander B, Al Ani HR. Prolonged partial cardiopulmonary bypass in rats. J Surg Res 35 (1983) 28-34.
3. Bachet J, Guilmet D, Goudot B, Termignon JL, Teodori G, Dreyfus G, Brodaty D, Dubois C, De- lentdecker P. Cold cerebroplegia. A new technique of cerebral protection during operations on the transverse aortic arch. J Thorac Cardiovasc Surg. 1991 Jul;102(1):85-93; discussion 93-4.
4. Bailes JE, Leavitt ML, Teeple E Jr, et al. Ultraprofound hypothermia with complete blood substitu- tion in a canine model. J Neurosurg 1991;74:781-8.
5. Barratt-Boyes BG, Neutze JM, Clarkson PM, et al. Repair of ventricular septal defect in the first two years of life using profound hypothermia-circulatory arrest techniques. Ann Surg 1976;184:376.
6. Baumgartner WA, Silverberg GD, Ream AK, Jamieson SW, Tarabek J, Reitz BA. Reappraisal of cardi- opulmonary bypass with deep hypothermia and circulatory arrest for complex neurosurgical op- erations. Surgery 1983;94:242-9.
7. Baumgartner WA, Williams GM, Fraser CD Jr, Cameron DE, Gardner TJ, Burdick JF, Augustine S, Gaul PD, Reitz BA. Cardiopulmonary bypass with profound hypothermia. An optimal preservation method for multiorgan procurement. Transplantation. 1989 Jan; 47(1):123-7.
8. Belzer FO, Southard JH. Principles of solid organ preservation by cold storage. Transplantation 1988;45:673.
9. Connolly JE, Roy A, Guernsey JM, Stemmer EA. Bloodless surgery by means of profound hypother- mia and circulatory arrest. Ann Surg 1965;162:724-36.
10. de Lange F, Yoshitani K, Podgoreanu MV, Grocott HP, Mackensen GB. A novel survival model of cardioplegic arrest and cardiopulmonary bypass in rats: a methodology paper. J Cardiothorac Surg 3 (2008) 51.
11. Ergin MA, O'Connor J, Guinto R, et al. Experience with profound hypothermia and circulatory ar- rest in the treatment of aneurysms of the aortic arch. J Thorac Cardiovasc Surg 1982;84:649-55.
12. Fabre O, Zegdi R, Vincentelli A, Cambillaud M, Prat A, Carpentier A, Fabiani JN. A recovery model of partial cardiopulmonary bypass in the rat. Perfusion 16 (2001) 215-20.
13. Gollan F, Tysinger DS Jr, Grace JT, Kory RC, et al. Hypothermia of 1.5 C in dogs followed by survival. Amer J Physiol 1955;181:297-303.
14. Gunzinger R, Wildhirt SM, Schad H, Heimisch W, Mendler N, Grammer J, Lange R, Bauernschmitt R. A rat model of cardiopulmonary bypass with cardioplegic arrest and hemodynamic assessment by conductance catheter technique. Basic Res Cardiol 102 (2007) 508-517.
15. Haff RC, Klebanoff G, Brown BG, Koreski WR. Asanguineous hypothermic perfusion as a means of total organism preservation. J Surg Res 1975;19:13-9.
16. Haneda K, Thomas R, Sands MP, Breaseale DG, et al. Whole body protection during three hours of total circulatory arrest: An experimental study. Cryobiol 1986;23:483-94.
17. Jesch F, Sunder-Plassmann L, Pohl U, Messmer K. Total body washout (TBW) and circulatory arrest in profound hypothermia. In: Messmer K, Schmid- Schebein H, eds. Intentional Hemodilution, Biblthca Haemat, Vol 41. Basel, Switzerland: 1975;209-24.
18. Jungwirth B, Mackensen GB, Blobner M, Neff F, Reichart B, Kochs EF, Nollert G. Neurologic outcome after cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest in rats: description of a new model. J Thorac Cardiovasc Surg 131 (2006) 805-12.
19. Kiyoshi H, Thomas R, Sands MP, et al. Whole body protection during three hours of total circulato- ry arrest: An experimental study. Cryobiol 1986;23:483-94.
20. Klebanoff G, Phillips J. Temporary suspension of animation using total body washout and hypo- thermia: A preliminary report. Cryobiol 1969;6:121-5.
21. Klebanoff G. Infectious hepatitis complicated by coma: principles of management including the ad- junctive use of asanguineous hypothermic total body perfusion. Resuscitat 1972;1:327-33.
22. Ma H, Yang J, Lynch N, Franks P, Maze M, Grocott HP. Xenon attenuates cardiopulmonary bypass- induced neurologic and neurocognitive dysfunction in the rat. Anesthesiol 98 (2003) 690-8.
23. Moehrlen U, Stammberger U, Moehrlen C, Schmid RA. Partial cardiopulmonary bypass in rats using a hollow fibre oxygenator. Interact Cardiovasc Thorac Surg 2 (2003) 603-6.
24. Neely WA, Haining JL. Survival after suspension of perfusion during asanguineous cardiopulmo- nary bypass. Ann Thorac Surg 1968;5:222-7.
25.Sasaki, S. Takigami, K. Shiiya N., and K. Yasuda, Partial cardiopulmonary bypass in rats for evaluat- ing ischemia-reperfusion injury. ASAIO J 42 (1996) 1027-30.
26.Smith AU. Studies on golden hamsters during cooling to and rewarming from body temperatures below 0 C. II. Observations during and after resuscitation. Proc Roy Soc B 1956;145:407-426.
27.Smith AU. Viability of supercooled and frozen mammals. Ann NY Acad Sci 1959;80:291-300.
28.Southwick FS, Dalglish PH Jr. Recovery after prolonged asystolic cardiac arrest in profound hypo- thermia. JAMA 1980;243:1250-3.
29. Taylor MJ, Bailes JE, Elrifai AM, Shih TS, Teeple E, Leavitt ML, Baust JC, Maroon JC. Asanguineous whole body perfusion with a new intracellular acellular solution and ultraprofound hypothermia provides cellular protection during 3.5 hours of cardiac arrest in a canine model. ASAIO J. 1994 Jul-Sep;40(3):M351-8.
30. Ramsay M. Advances in transplantation 1940-2014. Anesthesiology clinics 2013; 31: 645-58.
31. Andjus RK. Suspended animation in cooled, supercooled and frozen rats. J Physiol 1955 128(3): 547-556.
32. Andrews MT. Advances in molecular biology of hibernation in mammals. Bioessays 2007; 29(5): 431-440.
33. Baumgart R, Georgieff M, et al. Cardioprotection by Hydrogen Sulfide: Suspended Animation, In- flammation, and Apoptosis" Shock 2008.
34. Blackstone E, Morrison M et al. H2S induces a suspended animation-like state in mice. Science 2005 308(5721): 518.
35. Casas, F, Alam H et al. A portable cardiopulmonary bypass/extracorporeal membrane oxygenation system for the induction and reversal of profound hypothermia: feasibility study in a Swine model of lethal injuries. Artif Organs 2005 29(7): 557-563.
36. Nozari A, Safar P et al. Suspended animation can allow survival without brain damage after trau- matic exsanguination cardiac arrest of 60 minutes in dogs. J Trauma 2004 57(6): 1266-1275.
37. Taylor MJ, Rhee P, et al. Design of preservation solutions for universal tissue preservation in vivo: demonstration of efficacy in preclinical models of profound hypothermic cardiac arrest. Transplant Proc 2005 37(1): 303-307.
38. Артюхов ИB, Пульвер АЮ, et al. Предполагаемые механизмы криопротективного действия ксенона: результаты молекулярного моделирования. БИОФИЗИКА ЖИВОЙ КЛЕТКИ 2014 10: 28–31.

Скачать podgotovitelnyy-etap-glubokogo-obratimogo-okhl.pdf (890.38 Kb)
 

Вверх